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細胞培養(yǎng)的具體操作步驟以及注意事項

  • 發(fā)布日期:2021-04-08      瀏覽次數(shù):993
    •   細胞培養(yǎng)的具體操作步驟以及注意事項
        細胞培養(yǎng)(cell culture)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù),在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。
        不論對于整個生物工程技術(shù),還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說,細胞培養(yǎng)都是一個*的過程,細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)??寺 <毎囵B(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié),而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。
        細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中重要和常用技術(shù),通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞,又可以借此研究細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。
        一、細胞復蘇
        將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中,加入10ml預熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。
        加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
        二、細胞傳代
        細胞密度達到80%~90%時.去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。
        加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進行計數(shù),按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
        三、細胞凍存
        細胞密度達到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。
        加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異bing醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。
        凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。
        注意事項
        (1)進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時,必須嚴格按照下列步驟操作:
        ①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題,不確定的溶液和耗材請勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶液。
       ?、诖_定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。
       ?、鄞_定酒精燈內(nèi)的酒精量,需要的話及時進行補充。
       ?、艽_定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋,實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。
       ?、荼M量不要直接傾倒溶液,除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗,溶液粘在瓶口,請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍(不要接觸到瓶口)后在火焰上簡單燒灼。
        ⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,必須及時更換。
        ⑦實驗完畢及時收拾,保持工作區(qū)域清潔整齊,最后用75%酒精清潔臺面。
       ?。?)細胞污染的預防
       ?、賹嶒炗闷贩乐刮廴?。細胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*,各種溶液滅菌要仔細,并在無菌實驗檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
       ?、诓僮鬟^程防止污染。
       ?、鄞┲菀灼痨o電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進入細胞間。
       ?、軐嶒為_始前需要確定戴的手套沒有問題,只要接觸過生物安全柜之外的物品,必須及時對手套進行消毒。
        ⑤進入細胞培養(yǎng)間后關(guān)好門,坐下來盡量少走動以免影響生物安全柜的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大規(guī)模污染。
       ?、藜毎僮鲿r動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動燒灼,注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。
       ?、邔嶒灢僮鲿r生物安全柜的隔板要盡可能放低,盡量減少談話,打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區(qū),以免造成不必要的污染。
       ?、嗥可w應當?shù)狗旁谶h離自己的地方,以避免瓶蓋被誤操作所污染。
       ?、岵灰獜某ㄩ_的容器口上方經(jīng)過,以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。
       ?、鈱嶒灢僮鲿r要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管,切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾,保持實驗室清潔整齊,最后用75%酒精清潔臺面。
        (3)防止細胞交叉污染
       ?、僭谶M行多種細胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴格區(qū)分,作上標記便于辨別。按順序進行操作,一次只處理一種細胞,多種細胞多種操作一起進行時易發(fā)生t昆亂。
       ?、谠谶M行換液或傳代操作時,粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口,以免把細胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細胞。
       ?、鬯屑毎坏┵徶?,或從別處引入,或自己建立,必須及時保種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復蘇細胞,繼續(xù)培養(yǎng)。

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